铁皮石斛Dendrobium officinale是兰科石斛属植物，在我国作为传统的中药材和保健品，具有悠久的利用历史，被誉为“九大仙草”之首。铁皮石斛在我国虽然分布广泛，但由于历史上长期的过度采集，目前野外仅存零星的个体，被IUCN红色名录评估为极度濒危物种（Critically Endangered Species），同时也被《国家重点保护野生植物名录》（2021版）列为国家二级重点保护植物。兰科植物的种子非常细小，一个蒴果有几千至几百万粒粉末状的种子，称之为“尘埃种子（dust seeds）”，种子体积微小、胚未完全分化、没有胚乳，自然条件下需要依靠特定的菌根真菌提供营养才能萌发。虽然铁皮石斛早已经实现了种子在人工培养基上进行非共生萌发生产种苗，通过大棚集约化模式进行栽培，并由此形成和发展成为了规模巨大的药用石斛产业，但随着栽培规模的不断扩大，在产能过剩的同时，也带来了药材质量和安全性等方面的问题。目前，我国的中药材产业也向着生态种植的方向转变，国家《中医药振兴发展重大工程实施方案》把建设珍稀濒危中药材野生抚育、人工繁育基地，广泛开展中药材生态种植、野生抚育和仿野生栽培，开发中药材林下种植模式并示范推广，作为中药质量提升及产业促进工程的重要建设任务。

    兰科植物种子的非共生萌发技术却难以在濒危物种的种群恢复及药用兰科植物的仿野生栽培上应用，主要问题是种子非共生萌发的种苗成本高，移栽到自然环境中成活率低，而兰科植物种子的共生萌发，是在自然条件下，从种子到幼苗都有菌根真菌的参与，能更好的适应环境，在幼苗成功建立和后续生长上都具有优势，对于具有一定个体数量的种群恢复或规模化仿野生栽培而言，不仅成本低，同时可以利用不同遗传来源的种子使恢复种群保持较高的遗传多样性。生态与环境学院兰科植物综合保护和利用研究团队，针对铁皮石斛的保护和资源利用，在种子与真菌共生萌发及相关技术的应用上，取得了系列进展。

    2017级硕士研究生王新菊从铁皮石斛原生境种子自然萌发形成的原球茎中分离筛选得到了菌株Sebacinales LQ，能迅速促进铁皮石斛种子萌发形成幼苗，研发了“真菌-种子袋fungus-seed bags”，作为铁皮石斛回归及种群恢复的繁殖体（Wang et al., 2021; 专利授权号：201910945692.X）。2021-2022年间，在广南-罗平县一带的喀斯特地区铁皮石斛原生地，分不同批次，投放了约30万个铁皮石斛“真菌-种子袋”，种子20-30天左右开始萌发，50-60天后大量形成幼苗，幼苗率按每袋平均种子数统计高达35.90 ± 4.21%，以种子袋为单位统计则幼苗率为93.83±2.99%，60天时，幼苗率已趋于饱和达到68.19 ± 3.8%，和90天时的幼苗率70.09±3.2%无显著差异，90天时大部分幼苗已长出3-4片叶并已生根。铁皮石斛在多数原生境中是附生于岩石上，但“真菌-种子袋”在岩石上应用却由于无法保湿，种子不能萌发，针对这一问题，2020级硕士研究生杨华研发了“兰科植物种子-真菌复合体orchid seed-fungus complex”，即把一定数量的兰科植物种子和其亲和菌株的培养菌丝制成悬浮液，采用“人工种子”的方法包埋形成“种子-真菌复合体”，种子和菌丝均匀散布于复合体中，“种子-真菌复合体”可作为一个独立的繁殖体进行直接播种（Yang et al., 2023; 专利申请号：202110585205.0）。

    2017级硕士研究生陈德贇利用铁皮石斛无菌幼苗移栽到原生境，诱导幼苗产生菌根，分离筛选能促进幼苗生长的菌株（Chen et al., 2021; 专利授权号：202010657855.7; 专利申请号：201811336147.2）；在此基础上，采集了铁皮石斛6个不同生境的基质进行无菌幼苗栽培，诱导菌根形成，分离获得不同生境条件下与幼苗形成共生的菌根真菌， 2019级硕士研究生吴益花对不同生境铁皮石斛幼苗的菌根真菌的多样性和差异进行分析，对优势菌株的功能进行验证，筛选获得了对铁皮石斛幼苗生长具有不同促进作用的菌株（Wu et al., 2022; 专利申请号：202210025518.5、202210025522.1、202210026007.5、202210025989.6、202210025532.5），目前利用这些菌株，正和企业开展复合微生物菌肥及铁皮石斛功能性栽培基质的研发。博士后张锡庆以铁皮石斛不同基因型种子萌发获得的原球茎为外植体，建立多倍体诱导技术体系，并利用四倍体无菌茎节诱导类原球茎建立高效的再生体系，同时对整个基因组加倍对铁皮石斛植株表型和代谢物组成和含量的影响进行了研究（Zhang et al., 2020; 2021），所得到的铁皮石斛四倍体植株在野外栽培试验表现出极好的生长特性和抗逆性，目前和相关企业合作开展系统的性状评价，拟申报药用石斛新品种进行推广应用。2019级硕士研究生陈香归和2017级博士研究生麻广慧对种子与真菌的共生机制开展了研究，发现亲和真菌可快速侵染种子，随着菌丝在种子内部的定植和菌丝团（pelotons）的形成，种子也迅速萌发和形成幼苗，在对铁皮石斛的研究中，亲和菌株LQ和铁皮石斛种子共生培养10天左右，即可侵染种子形成菌丝团，真菌菌丝侵染并定植种子的程度与种子萌发和幼苗发育的形态分化非常吻合，种皮并未参与到共生关系的建立中（Chen et al., 2022; Ma et al., 2022）。

    以上相关研究获得了NSFC-云南联合基金重点项目（U1702235）和云南大学教育部部省合建重点项目（C176280109）资助。目前，相关研究成果在“十四五”国家重点研发计划“绿色宜居村镇技术创新”（2022YFD1100405）和云南省科技厅-云南大学“双一流”建设联合专项-重大项目（202201BF070001-017）的资助下正开展示范和推广，为生物多样性保护与乡村振兴相结合提供新的模式。通过以上研究的开展，从实践中发现科学问题，再把研究成果应用于保护实践，研究生基于自己的研究成果，参加中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛获得获云南省金奖4项、全国总决赛银奖1项，王新菊同学获2022年“云南省创新之星”称号，兰科植物综合保护和利用研究团队2022年获得云南大学首届“云南大学青年五四奖章（集体）”称号，“生物多样性保护与乡村振兴相结合培养理论与实践复合型人才”获2022年云南省研究生教学成果二等奖。

图1， 铁皮石斛“真菌-种子袋”和“种子-真菌复合体”。A：用保鲜膜将“真菌-种子袋”固定在树干上3个月后，即可产生大量的幼苗；B：每个“真菌-种子袋”可产生8-15株幼苗，1年后的幼苗情况；C：把铁皮石斛种子和亲和菌株的菌丝包埋形成的“种子-真菌复合体”，播种30天可见种子萌发形成绿色的原球茎；D：“种子-真菌复合体”播种60天形成的幼苗。

相关研究论文和已授权专利：

● Yang Hua, Neng-Qi Li, Jiang-Yun Gao*. 2023. A novel method to produce massive seedlings via symbiotic seed germination in orchids. Frontiers in Plant Science. 14: 1114105. doi: 10.3389/fpls.2023.1114105

● Wu Yi-Hua, De-Yun Chen, Xin-Ju Wang, Neng-Qi Li, Jiang-Yun Gao*. 2022. Using ex situ seedling baiting to capture seedling associated mycorrhizal fungi in medicinal orchid Dendrobium officinale. Journal of Fungi. 8: 1036. doi: 10.3390/jof8101036

● Chen Xiang-Gui, Yi-Hua Wu, Neng-Qi Li, Jiang-Yun Gao*. 2022. What role does the seed coat play during symbiotic seed germination in orchids: an experimental approach with Dendrobium officinale. BMC Plant Biology. 22:375. doi: 10.1186/s12870-022-03760-0

● Ma Guang-Hui, Xiang-Gui Chen, Marc-Andre´ Selosse，Jiang-Yun Gao*. 2022. Compatible and incompatible mycorrhizal fungi with seeds of Dendrobium species: the colonization process and effects of coculture on germination and seedling development. Frontiers in Plant Science. 13: 823794. doi: 10.3389/fpls.2022.823794

● Wang Xin-Ju, Yi-Hua Wu, Xing-Jia Ming, Gang Wang, Jiang-Yun Gao*. 2021. Isolating ecological-specific fungi and creating fungus-seed bags for epiphytic orchid conservation. Global Ecology and Conservation. 28: e01714. doi:10.1016/j.gecco.2021.e01714

● Chen De-Yun, Xin-Ju Wang, Tai-Qiang Li, Neng-Qi Li, Jiang-Yun Gao*. 2021. In situ seedling baiting to isolate plant growth-promoting fungi from Dendrobium officinale, an over-collected medicinal orchid in China. Global Ecology and Conservation. 28: e01659. doi:10.1016/j.gecco.2021.e01659

● Zhang Xiqing, Jiangyun Gao*. 2021. Colchicine-induced tetraploidy in Dendrobium cariniferum and its effect on plantlet morphology, anatomy and genome size. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 144:409-420. doi: 10.1007/s11240-020-01966-4

● Zhang Xiqing, Jiangyun Gao*. 2020. In vitro tetraploid induction from multigenotype protocorms and tetraploid regeneration in Dendrobium officinale. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 141:289-298. doi: 10.1007/s11240-020-01786-6

● 高江云，陈德贇. 一株促进药用铁皮石斛幼苗生长的真菌，专利号：202010657855.7, 授权公告日2021.12.10。

● 高江云，王新菊. 一株促进药用石斛种子萌发形成幼苗的蜡壳耳目真菌菌株及其应用，专利号：201910945692.X, 授权公告日2021.02.12。